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定点突变试剂盒可用于点突变，核苷酸替换和删除或者插入单一或多个相邻核苷酸。本试剂盒可简单、快速和高效地引入正确的目的突变，可将多达12个寡苷酸插入和/或删除到双链的长达8kb的质粒中。整个过程(包括转化)可在3小时内完成。

为得到目的突变位点，需设计两个含有中心突变位点的互补诱变引物。这两个引物在目标载体上退火到相反的链上，然后Pfu DNA Polymerase利用引物扩增整个目标载体。PCR扩增产生大量带缺刻的开环突变质粒。然后用Dpn I限制性内切酶消化残留的甲基化模板和任何半甲基化的DNA。带缺刻的DNA载体含有目标突变位点，被转化到DH5α感受态细胞后载体的缺刻得到修复。

2.68kb的pUC19对照质粒的Hind III限制性酶切位点序列的“AG”发生移码突变，突变位点在lacZα基因上。突变的对照质粒在含有X-galactosidase (X-gal)的平板上表现为白色菌落。对照质粒同时含有氨苄青霉素抗性；因此筛选时，使E.coli生长在含有氨苄青霉素(和X-gal)的平板上。另外，pUC19对照质粒不能被Hind III酶切。根据对照实验，pUC19对照质粒的回复突变可被Hind III切割。

• 突变引物设计原则
  
  • 突变引物对应当含有预期的突变位点并退火到目标载体的相反链上。
    
  • 引物应为30～45个碱基，解链温度(Tm)在75℃至85℃。
    
  • 一般以突变(替换、删除、插入)的碱基为中心，加上两边长度为11～21个碱基左右一段正确序列。
    
  • 引物GC含量至少为40%，并且以G或C结束。
    
  • 如要获得更多关于突变引物设计的信息，请参阅PrimerX，这是个免费的自动设计突变引物的在线工具。
    
  • PrimerX设计的的重叠延伸突变引物也适用于本试剂盒。
• 突变PCR
  
  • 根据下表准备对照组的反应体系
    

    成分	用量
    10×Pfu Buffer with MgSO4	5μL
    10mM dNTP Mix	1μL
    Control Forward Primer(10μM)	1μL
    Control reverse Primer(10μM)	1μL
    pUC19 White Control Plasmid(5ng/μL)	1μL
    Pfu DNA Polymerase(2.5U/μL)	1.2μL
    Sterilized ddH2O	至50μL

  • 根据下表准备样品的反应体系
    

    成分	用量
    10×Pfu Buffer with MgSO4	5μL
    10mM dNTP Mix	1μL
    Forward Primer(10μM)	1μL
    Reverse Primer(10μM)	1μL
    Template Plasmid(10ng/μL)	0.5～1μL
    Pfu DNA Polymerase(2.5U/μL)	1.2μL
    Sterilized ddH2O	至50μL

  • 将样品放入循环仪并根据下列程序开始PCR
    

    步骤	温度	时间	循环次数
    预变性	95℃	3min	1
    变性	95℃	30s	12～18
    退火	60℃	1min
    延伸	68℃	2min/kb
    最终延伸	68℃	10min	1

• Dpn I消化扩增产物
  直接加入1μL Dpn I限制性酶(10U/μl)到每个扩增反应中。温和并彻底地混匀每个反应混合液，迅速旋下反应混合液，37℃孵育1h，消化亲本模板。
  
• 转化和分析
  
  • 每个转化反应均需冰上融解100μL DH5α感受态细胞。
    
  • 直接将5～10μL Dpn I消化产物加入到DH5α感受态细胞并用移液枪温和混匀。
    
  • 冰上孵育30min。
    
  • 42℃热激90s，立即冰浴2～3min。
    
  • 将LB培养基(400～600μL)加入细胞，温和混匀，37℃振荡培养1h，转速为220rpm。
    
  • 取100～200μL细胞涂布到琼脂平板上，其中含有适合质粒载体抗性的抗生度。作为突变和转化的对照组，将细胞涂布到含有氨苄的LB琼脂平板上，平板添加有X-gal和IPTG。
    
  • 37℃过夜培养。.
    
  • 选择3～5个菌落，通过质粒抽提、PCR或测序分析结果。DNA测序是为了证明突变成功，并且基因的其它区域不含有另外的突变。
• 突变效率
  
  • 用这种方法获得的突变效率往往高于80%。
    
  • 白色对照pUC19突变后转化得到的预期菌落数≥100个。在含有IPTG和X-gal的琼脂平板上的菌落超过80%表现为蓝色。